合成肽疫苗的切磋最先始于FMDV合成肽疫苗,就接受了8株FMDV用于疫苗的生育

By admin in 未分类 on 2019年12月23日

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth
disease
virus,FMDV)引起的偶蹄动物的烈性传染病之一。由于FMD暴发引起幼小动物死亡、成年动物生产能力降低,并由此而导致疫区畜产品禁运,造成重大经济损失。目前,FMD呈全世界范围流行趋势。疫苗接种作为特异性预防的可靠工具和有效手段,在FMD的防控中已被广泛使用,并取得了显着成效,目前仍在许多国家和地区应用。有FMD流行的国家每年进行有计划的免疫接种,无FMD或已消灭FMD的国家和地区仍在国际疫苗库中储备了一定数量的疫苗。因此,高质量安全有效的FMD疫苗的研制和不断改进,不但是决定疫苗效果的关键,亦是成功地预防和控制以至最终消灭FMD的先决条件。

引言

文章摘要:

1灭活疫苗的研究

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease
virus,FMDⅥ引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,以宿主范围广、传染性强、传播迅速著称,因严重危害发病动物的生产性能和畜产品质量在造成巨大经济损失的同时极大地冲击爆发国家的国际贸易,被世界动物卫生组织列为A类疾病。口蹄疫病毒共分为A、O、C、Asia
l、SATl、SAT2、SAT3七个血清型,各血清型间缺乏交叉保护性,不同血清型的亚型和分离株间抗原变异很大。目前,对于口蹄疫的防治以免疫接种为主,常用口蹄疫疫苗主要有弱毒疫苗、灭活疫苗和新型疫苗3种,不同种类疫苗在不同国家和地区以及口蹄疫流行不同阶段的防治中发挥了不同的作用。基于良好的免疫保护性,口蹄疫灭活疫苗和弱毒疫苗在以往口蹄疫防治中发挥了巨大作用,但是由于灭活不彻底及弱毒苗毒力返强可能导致的病毒外散带来的安全隐患,研究者一直在寻找一种更为安全有效的口蹄疫疫苗。随着“表位生物学”概念的提出,许多蛋白类抗原的表位相继得到鉴定,口蹄疫病毒抗原位点定位的研究日益明朗,但由于病原微生物的多样性和变异性,制作全价通用疫苗愈来愈困难,使多肽疫苗开始受到人们广泛的重视,并呈现出巨大的发展空间。

猪瘟(slassicalswinefever,CFS)以出血和发热为主要特征,呈急性或慢性经过,是一种对猪危害性极大的传染病,被国际兽疫局(OfficeofInternationaldesE’pizooties,OIE)列为A类动物传染病。在世界许多国家和地区,传统疫苗接种是控制猪瘟的重要手段。

1931年4月27柏林微生物学会首次召开了FMD学术会议,奠定了FMD疫苗研究基础。Frenkel
H
S等[1]成功地实现了FMDV体外培养,不但满足了FMDV疫苗的规模化生产要求,而且实现了对病毒的定量研究。目前用于FMD疫苗生产的细胞主要是BHK-21细胞。疫苗生产过程主要包括FMDV的细胞培养,FMDV细胞培养物的浓缩、灭活,佐剂的加入,安全性检验和效力检验等程序。进行FMD疫苗生产时首先要考虑FMDV血清型,其次要了解当地FMD的流行情况,最终确定用于FMD疫苗生产的毒株。如果对当地FMD流行情况不了解,或本地区进出口贸易把关不严,周边国家或其他距离较远的国家FMD有可能传入本国或地区时,FMD疫苗生产就要选择所有可能对本地区构成威胁的FMDV毒株。比如一些阿拉伯半岛国家,就选择了8株FMDV用于疫苗的生产,以期生产出能够预防本国或地区所有潜在FMD疫苗。尽管FMD灭活疫苗在FMD预防和控制上,发挥了重要作用,但是灭活疫苗本身也存在许多安全隐患,国外学者先后用分子生物学方法证明欧洲暴发的FMD是因使用了灭活不全的FDM疫苗引起的。具有讽刺意义的是在欧洲国家尽管通过免疫成功实现对FMD暴发流行控制,但在1992年欧洲经济委员会还是放弃了疫苗的使用,该决策是否正确,还有待观察,因为在西欧的一些周边国家仍然存在FMD的流行。

1、合成肽疫苗概述

目前使用的弱毒疫苗主要是中国猪瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE疫苗和法国的Thireval疫苗。我国的猪瘟兔化弱毒疫苗性能稳定、安全、免疫效果好,且无残留能力,是国际公认的唯一安全有效的弱毒疫苗,亦是国内唯一应用的弱毒疫苗。20世纪70年代后期,猪瘟的流行形式发生了很大变化。地区散发性流行及非典型猪瘟症状的发生,特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C-株检测时发现有不同的反应模式,猪瘟免疫屡屡失败等,表明猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)的抗原性可能存在着变异,从而使有人对传统弱毒疫苗提出了质疑。随着传代次数的增加和对不同细胞的适应性繁殖,疫苗毒株可能发生异质性或抗原漂移;加之数十年来CSFV在大规模免疫接种压力下可能出现抗原变异。

2新型疫苗研究

合成肽疫苗(synthetical peptide
vaccine)是依据天然蛋白质氨基酸序列一级结构用化学方法人工合成包含抗原决定簇的小肽(约20-40个氨基酸),通常包含一个或多个B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。该疫苗是一种完全基于病原体抗原表位或者决定簇氨基酸序列特点开发设计的一类疫苗,不存在毒力回升或灭活不全的问题。特别是对于还不能通过体外培养方式获得足够量抗原的微生物病原体或虽能进行体外培养,但有潜在致病性和免疫病理作用等涉及安全性与有效性问题的病原体意义重大。

这些情况都表明,现有的传统疫苗已不能适应新形势的需要,研究和开发新型猪瘟疫苗机是大势所趋。分子生物学技术的兴起和发展,为新型猪瘟疫苗的研究和开发奠定了基础。

2.1病毒载体疫苗

合成肽疫苗的研究最早始于FMDV合成肽疫苗,主要集中在FMDV的单独B细胞抗原表位或与T细胞抗原表位结合而制备的合成肽疫苗研究。

1.开发新型猪瘟疫苗的分子生物学基础CSFV是一种小的有囊膜病毒,含有单股正链RNA基因组。

在漫长的自然进化过程中,病毒是以寄生形式存活下来的最小、最简单的生命体,随着病毒分子生物学的深入发展,为生物工程研究领域拓展了思路,提供了有效的方法和工具。以病毒为载体的新型疫苗成为了基因工程的研究热点之一,病毒重组活载体疫苗可被视为减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合,它既可以避免亚单位疫苗需要佐剂和多次接种注射的缺点,又可以诱导全面而持久的免疫反应。可作为减毒活疫苗的病毒载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒、脊髓灰质炎病毒和单纯疱疹病毒等,目前已用于FMD疫苗研究的载体主要有痘病毒、腺病毒和杆状病毒载体等。

1.1表位肽选择与合成

CSFV基因组长约12.5kb,由一个大的开放性阅读框架和两侧的5’-端非翻译区和3’-端非翻译区构成。编码蛋白顺序为Npro、C、Erns、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3。除C、Erns、E1和E2为结构蛋白外,其余均为非结构蛋白。

2.1.1FMDV腺病毒重组活载体疫苗人腺病毒弱毒疫苗的安全有效使用,奠定了腺病毒作为载体研制的基础。第1代腺病毒载体起于20世纪80年代初,至今腺病毒载体已经经历了4代发展[2-3]。在腺病毒载体快速发展的同时,Sanz
Parra
A等[4]用人的可复制的5型腺病毒疫苗株载体,构建了表达FMDV结构蛋白P1基因的重组腺病毒活载体疫苗Ad5-P1。用Ad5
wt和重组的Ad5-P1经皮下或鼻内接种牛,在第2次免疫后鼻内滴注口蹄疫病毒进行攻毒。虽然未检测出抗口蹄疫病毒抗体,但经重组病毒皮下接种两次的所有动物均得到有效的保护。后来,Mayr
G
A等[5]构建了可以表达FMDV衣壳蛋白P1-2A和3C蛋白酶基因的非复制型人5型腺病毒载体,被挑选出来两个重组病毒:含有3C蛋白酶的Ad5-P1和在蛋白酶编码区进行点突变的抑制多聚蛋白加工的Ad5-P12X3CMUT。在293个病毒感染细胞中,FMDV的衣壳蛋白均能合成,但能够将其加工成结构蛋白VP0、VP3和VP1的仅仅是Ad5-P12X3CWT病毒感染的细胞。通过用型特异性的单克隆抗体进行的免疫沉淀试验,结果表明,在Ad5-P12X3CWT病毒感染的细胞中可能形成较为高级的结构形式。口蹄疫病毒常经肌肉接种小鼠产生相应的免疫反应,但仅仅含有3CWT的病毒才能表达中和抗体反应。在增加基础免疫以后,中和抗体反应的程度增加了。猪肌肉接种AD5-P12X3CWT重组病毒后能够产生中和抗体,并可完全或部分保护与人工接种强毒的动物相接触的猪免受病毒的感染。因此,腺病毒可以作为一种有效的表达FMDV的主要决定簇的抗原的载体,诱导高水平的中和抗体的产生,并保护动物免受FMDV的攻击。

1.1.1抗原表位的选择是肽疫苗研制的第一步目前,对于抗原位点的研究方法主要有计算机软件预测法、SDS-PAGE结合Western
blot技术分析法、化学或生物学方法(包括酶切割法和水解抗原一抗体复合物法)、肽探针扫描法、噬菌体表面展示技术、抗性突变体筛选法、缩氨酸扫描技术以及x射线衍射法和核磁共振法等。型内、型间特异性或保守性抗原位点序列单独或不同组合应用可以获得针对病原体特异或各型特异的疫苗。不同病原体关键位点的联合应用还可获得联苗的保护效果,降低因多次免疫可能给动物机体带来的损害。一般来说,要依研究目的、兴趣设计多肽片段,特别是在没有抗原位点精确结构信息的情况下更要根据研究用途或应用来选择设计策略。就疫苗研究来说,理想的表位应该是在病原体各型间或同一血清型内各分离株中高度保守的序列,特别是那些位于病原体表面、具有可及性的、中和性的、序列长度在8-20个氨基酸残基的抗原位点。如果肽段太短,则可能增加与其它病原的交叉反应,所产生的抗体与天然蛋白问的亲和力或者结合力弱;如果序列太长,则可能引入二级结构,失去抗体的特异性,而且肽链越长,通常合成难度越大,产品提纯也越困难。

在结构蛋白中,最具有免疫防制研究价值的是Erns和E2。Erns由227个氨基酸残基构成,分子量约为44-48ku,可诱导产生中和谱很窄的中和抗体。Erns没有疏水的膜锚定结构,为可分泌蛋白。它在由细胞以出芽或胞吐方式分泌的病毒颗粒囊膜上并不稳定,在细胞培养CSFV的上清液中含有少量的病毒粒子,但却含有大量被分泌出的Erns。Erns不仅是一种结构蛋白,而且也是一种功能性蛋白,它与CSFV对宿主细胞的嗜性以及致病力有密切关系。Erns有RNase活性,可降解病毒和细胞的RNA。Erns可导致免疫抑制,引起动物的淋巴和上皮细胞刁亡。CSFV的宿主嗜性也与Erns有关,用Erns中和单抗可有效阻断CSFV对易感动物细胞的感染。Erns还表现出神经细胞毒性和抗凝集活性,CSFV感染动物后所产生的Erns蛋白在致病过程中起重要作用。E2的分子量约为53-55ku。E2参与病毒对细胞的感染过程,携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇,起编码的gp55蛋白是猪瘟的主要保护性抗原。

Du
Y等[6]腺病毒载体构建了VP1基因和VP1主要抗原表位分别与巨噬细胞集落刺激因子共表达的重组活载体疫苗rAd-GMCSF-VPe
和rAd-GMCSF-VP1,研究结果表明两种疫苗均能诱导机体产生较高水平的FMDV特异性T淋巴细胞增殖反应、IFN-gamma和IL-4,而且rAd-GMCSF-VPe
和rAd-GMCSF-VP1均能对猪和豚鼠产生攻毒保护。

1.1.2多肽合成技术抗原多肽的合成目前主要包括片段浓缩法和固相合成法两种。前者先合成一定数量小肽,经纯化和去保护后结合成较长的肽,以此类推直到所需长度序列。后者是把目标肽链的第一个氨基酸碳端羧基共价结合在固相载体上(固相载体是一种不溶性的高分子树脂)。脱去氨基保护基团后,再加入氨基和羧基都结合了保护基团的另一个氨基酸,令这个氨基酸的羧基脱去保护基团,与结合在固相上的氨基酸氮端氨基形成肽键。如此多次重复,直至到所需长度的肽链;最后把肽链从树脂上裂解下来,经过纯化处理即得所要多肽。自1963年Merrifield成功发展固相多肽合成技术以来,经过不断改进和完善,该技术已成为多肽和蛋白质合成中的常用技术,特别是在选择和确定有效抗原表位研究方面,是合成肽疫苗的一条可供选择的途径。

靠近C端的疏水区为gp55的膜锚定结构后的第6个氨基酸至C端TMR之间形成有弹性的α螺旋结构,没有抗原决定簇。从N端693位至856位Cys之间形成富含抗原决定簇的2个抗原结构域,这2个结构域由位于737和792位Cys之间的一段片β片层结构隔开。693和737位Cys形成二硫键并组成一个序列非保守性抗原结构域,具有中和性的B、C抗原区位于该结构域中,另一个结构域属序列保守性,由792和856位Cys形成的二硫键组成,包含中和抗原区A和非中和抗原区D,而A和D区由其间的一个疏水区和818位、828位Cys形成的二硫键分开。在A、B、C3个中和区中,各有一段与中和性密切相关的高频突变序列或位点。这些序列或位点的突变株将逃脱中和性单抗的中和作用,免疫血清对对这类突变株的中和作用也会降低。全长感染性cDNA克隆技术使笔者得到了纯粹的CSFV基因组。这一成果为进一步研究CSFV的复制机理、毒力及其决定因素、致弱机理、致病机理、基因产物的功能、特异性诊断、宿主嗜性以及DNA疫苗和标记疫苗的开发等,打下了坚实的基础。目前为止,已经成功构建了CSFVC-株、Brescia-株和Alfort/187-株等全长感染性cDNA。

2.1.2FMDV痘病毒重组活载体疫苗痘苗病毒载体是研究最早和最成功的病毒载体之一。痘苗病毒具有宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因组容量大、含多个非必需区等优点,有利于进行基因工程操作和适于插入多个外源基因且抗原性稳定、免疫原性持久,能够同时诱发体液和细胞免疫,相对安全。

1.2肽疫苗种类

2.新型猪瘟疫苗的研究和应用前景

Berinstein以痘苗病毒为载体构建了表达FMDV
C3Arg85株衣壳蛋白前体P1基因的重组FMDV疫苗,免疫后可检测到高水平的FMDV和痘苗病毒的中和抗体,类似于灭活疫苗免疫所产生的抗体水平。经小鼠免疫试验表明,重组痘苗病毒抗FMDV的有效免疫原可以作为活载体疫苗。但痘苗病毒本身存在一些难以克服的缺点,如感染谱广,容易引发痘病等。有人采用金丝雀痘病毒为载体表达FMDV的VP1,其表达效率要比以痘苗病毒为载体高出100倍,具有良好的应用前景[7]。

依据合成肽疫苗中抗原肽的拷贝数、载体种类、佐剂等被分为几类,主要包括以下几种。

2.1CSFV基因缺失型弱毒疫苗通过非天然宿主传代选择得到的突变株,其基因组可发生多个突变。

此外,鸡痘病毒表达载体具有安全、高效、外源基因容量大,宿主范围较小等优点,为疫苗的研究提供了可能,具有很好的发展前景。作者所在课题组郑敏等用鸡痘病毒作载体构建了共表达FMDV
P1-2A和3C基因的重组疫苗,在小鼠和豚鼠免疫试验均表现出较好的免疫效果,并且在豚鼠攻毒试验中,可抵抗250
MID50同源病毒攻毒[8]。在此基础上Ma
Mingxiao等[9]构建用鸡痘病毒作载体构建了共表达FMDV
P1-2A,3C和猪IL18基因的重组疫苗,进一步提供了该重组疫苗的免疫效果,在猪的攻毒试验中,保护率可达到4/5。

1.2.1抗原肽一载体复合物除早期直接用作抗原免疫接种的较大的多肽(分子量5000
kD以上)外,抗原肽一载体复合物是肽疫苗中应用最早、最多的一类,主要以抗原肽一蛋白载体连接物形式呈现。用于与抗原肽交联的蛋白载体既有异体蛋白也有动物自体蛋白,有时还包括一些细胞因子类物质,以钥孔虫斤血蓝蛋白(keyhole
limpet hemacyanin,KLH),牛血清白蛋白(bovine serum
albumin,BSA),卵清蛋白(ovalbumin,OVA),牛甲状腺球蛋白(bovine
thyro~lobulin,THY),破伤风类毒素等较为常用。KLH因为有更强的抗原性,应用最广泛。BSA因经常被用做检测试验的阻断剂而使其应用受到一定限制。

当某些一病毒复制无关的毒力或相关基因缺失突变后,其毒力丧失或明显减弱,但病毒复制能力并不丧失,同时保持着良好的免疫原性。因此,通过基因工程技术致使病毒基因组中负责毒力的基因缺失,可以获得基因缺失型弱毒疫苗株。由于许多从RNA病毒获得的cDNA具有感染性,所以人们预测RNA病毒缺失株的研究也将逐步开展。由于缺失型弱毒苗是人为地将病毒的毒力基因切除,往往不可能完全自行修复,因而不会发生返祖现象,在遗传特性上比较稳定,是今后弱毒疫苗的研究方向之一。采用缺失的方法可能会制造出免疫原性好,且在安全性上更有保证的弱毒疫苗株,也可以改造现行的免疫原性还不能令人满意的弱毒株以增强其安全性。

2.1.3FMDV伪狂犬病毒载体重组活载体疫苗伪狂犬病毒载体就是通过基因工程技术使伪狂犬病毒载体中的毒力基因失活,使病毒的毒力减弱,但病毒粒子仍然保持良好的抗原性,能够有效地刺激机体产生免疫应答。重组病毒粒子同插入的外源基因一起在动物体内表达不仅十分安全,还可以做到一针多防,提高生产效率。伪狂犬病毒载体在基因表达、疫苗研制、基因投递和基因治疗等方面都显示了很好的优越性。Yao
Q等[10]用伪狂犬病毒载体构建了共表达O型FMDV的P12A3C基因的重组活载体疫苗,并与用P12A3C构建的DNA疫苗免疫效果进行了比较,结果表明,FMDV伪狂犬病毒重组活载体疫苗能诱导较高的抗体水平,对豚鼠的攻毒可完全保护,而DNA疫苗抗体水平较低,对豚鼠的攻毒只能部分保护。

1.2.2多抗原肽抗原基于抗原肽一载体复合物中的载体蛋白多为异体蛋白,同一载体连接的几个肽疫苗同时或相继使用时,高比率的载体蛋白可能引起接种机体的炎症或过敏反应,成为影响抗原肽特异性的原因。研究者利用增加抗原肽重复次数以增加抗原分子量的方法制备无载体蛋白合成多肽抗原,包括多聚抗原肽抗原、串联抗原肽抗原、含二硫键的链环和环状二聚体抗原肽抗原、树状多肽抗原肽抗原、含串联抗原肽的树状多抗原肽抗原等,其中多聚抗原肽抗原是研究最早的一类无载体蛋白合成肽疫苗用抗原,它主要将抗原肽利用缩合剂缩合成多聚物而成,其抗原性和免疫原性明显增加。

2.2CSFV亚单位疫苗应用化学的方法从病毒粒子中分离出保护性抗原可以制成亚单疫苗。

2.2核酸疫苗

串联抗原肽抗原是通过把相同或不同的肽段串联起来以增大抗原分子的分子量,可以通过逐步接长合成法得到。为增加抗原肽的分子量和免疫性,还可在抗原肽的端基加上半胱氨酸,经氧化后形成二硫键从而得到链状或环状抗原肽,该类抗原效果较好,如采用环状二聚体抗原的疟疾疫苗SPff66)ntl。

亚单位疫苗是病毒粒子的一部分,不含有核酸,非常安全。亚单位疫苗的免疫原性通常较低,需要与佐剂合用,或偶联到适当的载体上应用。从完整病毒粒子上制备具有免疫原性的亚单位疫苗时,由于抗原量的限制,制备过程复杂,成本往往比较高。因此,采用基因工程的方法,不仅能够克隆得到编码病毒保护性抗原的基因,而且能够在体外对其进行改造或修饰,并重新转移到异源生物宿主体内或培养细胞中,使病毒蛋白获得大量表达。利用真核细胞高效表达系统来表达CSFV免疫原蛋白,并以此表达产物为抗原可获得基因工程亚单位疫苗。Hulist等将猪瘟病毒E2基因cDNA重组入核型多角体病毒,并在sf21细胞中表达。用20-100ug的表达蛋白免疫猪,可抵抗100LD50的猪瘟强毒攻击,其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平。目前,该蛋白的表达水平已被提高至60ug/mL,并且该疫苗于1998面被列入欧洲药典。许多研究者对E2基因亚单位疫苗进行了效力试验,证明其对猪有良好的保护作用,但是不能有效防止猪瘟病毒的传播。杆状病毒系昆虫病毒,能够在宿主细胞内产生大量的蛋白晶状体——多角体蛋白。这些蛋白覆盖并保护着核体内的病毒粒子。该蛋白的表达受多角蛋白启动子调控。通过痘苗病毒等在细胞内表达的外源性病毒蛋白,经提纯后对动物也具有一定的免疫源性。杆状病毒-昆虫细胞系统可高水平表达外源蛋白,昆虫细胞对蛋白质的加工和运转过程与哺乳动物类似,所表达的蛋白“仿真”程度较高,已成为众多亚单位疫苗研究的工具。亚单位疫苗具有安全、稳定、可规模化生产等优点,同时又可根据流行毒株的变化更换合适的CSFVE2基因,因而具有广阔的应用前景。

DNA疫苗是指那些注入动物体内后能够诱导机体产生免疫反应的病毒保护性抗原基因表达质粒。早在20世纪70年代末,人们就证实了动物体内具有摄取裸露DNA分子的能力。20世纪80年代中期,利用克隆的目的基因,通过体内直接转染的方法大量用于基因治疗途径的研究。近几年,基因免疫在FMDV免疫研究中得到广泛的应用。

树状多抗原肽抗原(Dendritic Multiple Antigenic
Peptides,MAP)是利用赖氨酸含有的两个氨基为碳端,合成以Lys为核心含有两个抗原肽的抗原。连接n次Lys时,即可合成出以Lys为核心含有2n个抗原肽的抗原。这种设计使疫苗的一个分子中包含多种特异性表位,较单体肽具有明显优越性,可诱导更好的保护力。

2.3CSFV活载体重组疫苗某些病毒基因组的某一核苷酸序列,将其切除、突变或在该区域内插入外源性基因片段后,均不影响病毒的复制,是病毒的复制非必需区。

Beard
C等[11]构建了两个不同的质粒,一个质粒pP12X3C携带有FMDV衣壳蛋白前体基因P1和蛋白酶3C基因,用基因枪将该质粒接种动物可检测到特异性的体液反应。第2个DNA质粒pWRMHX,携带有编码完整病毒的基因组(但删除了其细胞结合位点),用该质粒接种猪后可以产生病毒样粒子并诱导产生中和抗体。比较两种质粒pP12X3C和pWRMHX接种猪后的效果结果显示,携带有复制病毒基因组的质粒DNA可以产生较强的免疫力,应用pWRMHX经肌肉注射、鼻内接种和基因枪途径接种的猪均对强毒攻击产生部分保护力。

含串联抗原肽的树状多抗原肽抗原兼备上述两类抗原优点,以Lvs为核心,以串联抗原肽代替上述单一抗原肽来实现,获得了较好的免疫力。

利用基因工程的方法可以将该复制非必需区克隆出来,体外改造后再将导源性病毒的保护性抗原基因及启动子调控序列等插入其中,通过体内同源重组技术获得重组病毒,利用该重组病毒接种动物,不仅可以诱导机体产生针对异源性病毒的特异性免疫反应,而且在采用宿主特异性载体病毒时,能够使宿主获得针对载体病毒株的免疫力。如果在载体病毒中同时插入多个异源性病毒的保护性抗原基因还可以达到一针防多病的目的。伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)基因组为一线性DNA分子,约150kb,外源基因可稳定地插入其DNA。将与PRV毒性相关的糖蛋白I基因灭活,使PRV弱毒化,从而成为发展亚单位重组疫苗的一个较理想载体。将CSFVE2基因克隆到该病毒活载体上,即可获得对伪狂犬病和猪瘟的双重保护。Moormann等于1996年拼接出C-株感染性全长cDNA,用强毒E2基因取代原有E2基因,构建出了猪瘟杂交病毒。这一技术改变了传统意义上的弱毒疫苗研究程式,并且在研究猪瘟病毒的基因功能和感染、复制、免疫机理方面具有重大意义。目前用于表达外源性病毒蛋白的载体包括PRV、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒和小RNA病毒等。以无致病力或低毒力的活病毒为载体,将猪瘟病毒E2基因与之重组研制出的基因重组疫苗免疫动物后,可对2种病毒产生良好的保护力。但是,目前对此类疫苗的安全性和实用价值还有争议,因为人类至今还不了解病毒的自然发生及变异机理,也就无法控制这“人造”病毒的未来走向,一旦将该病毒放入自然界中,重组疫苗载体株与其他弱毒性突变株,有可能改变其生物学特征,衍变出对人、兽有害的病毒变种。另外,利用较为普遍的病毒作为活载体所获得的CSFV活载体重组疫苗对于活载体相应病毒感染或已免疫的动物不能产生保护力。

Chan E
W等[12]构建pCEIM和pCEIS两个质粒,它们分别含有FMDV的VP1基因的主要抗原位点(氨基酸残基的第141位~160位和200位~213位氨基酸)和鼠及猪的免疫球蛋白基因。用它们分别接种小鼠和猪,前者可刺激小鼠产生特异性的T淋巴细胞增生和中和抗体。后者两次免疫的猪也出现T淋巴细胞增生,并产生高效价的中和抗体。在攻毒实验中,应用pCEIS
进行免疫的猪可百分之百的保护。

2、口蹄疫合成肽疫苗研究概况

2.4SCFVDNA疫苗DNA疫苗是指注入动物体内后能够诱导机体产生免疫反应的病毒保护性抗原基因组表达质粒。

Ma Mingxiao等[13]在总结国内外学者研究的基础上,利用FMDV
2A蛋白自身裂解性和双启动真核表达载体,构建了FMDV P1-2A、猪IL-18和FMDV
3C共表达的核酸疫苗pVIR-P12AIL18-3C和不携带猪IL-18的核酸疫苗pVIR-P12A-3C,研究结果表明,两个核酸苗均对同源FMDV对猪的攻毒具有很好的保护性,且携带有猪IL-18基因的核酸苗免疫效果优于不携带猪IL-18的核酸疫苗。

口蹄疫病毒主要包括4个结构蛋白,即VPl、VP2、VP3、VP4,其中前3个暴露于病毒粒子表面,后者位于病毒内部。现有研究表明,具有良好免疫原性的抗原位点主要集中于VPl上,其中VPl
141—160氨基酸序列已证明可在多种动物诱导保护性中和抗体。

美高梅在线登录网址美高梅手机版登陆4688 ,以配有原核复制元件和真核表达调控元件的质粒载体,将免疫原基因插入该质粒中,用裸DNA接种动物可产生免疫保护。在保证该重组子在注射动物后不会发生散播,即不具有传染性的同时,该重组子在动物体内对细胞的传染率及在细胞内的表达水平将影响该疫苗的免疫效力。DNA疫苗是近年发现并形成的一种新疫苗,已有许多用该技术将一些具有药用价值的活性蛋白基因与载体重组,注射动物后成功产生活性蛋白的例子。Yu等Hammond等和Andrew等分别构建了CSFVE2基因的重组表达质粒,并且证明它对猪有较好的保护作用。重组DNA可通过发酵培养方式大量制备,又具有相对较好的稳定性,并且大容量的质粒还可同时容纳多种病毒的免疫原基因。DNA疫苗免疫的最大优点是可以在同一时间,通过质粒携带的编码不同病毒抗原的基因进行免疫。若同时将编码细胞因子的基因插在质粒上,不但可以提高免疫反应,而且可以使反应从Th1向Th2型过渡。这样通过使用合适的启动子、细胞因子和适当的载体,不但可以产生终身免疫,同时还可以调控免疫反应的类型。另外,DNA疫苗还可有效排除母源抗体的干扰。核酸疫苗虽起步较晚,但具有很大的开发潜力和应用前景。如果核酸疫苗潜在的安全性和接种方法能够得到解决和改进,那么,CSFV核酸疫苗会为猪瘟疫苗研究领域注入新的活力。

2.3亚单位疫苗与合成肽疫苗

1985年,Francist21用FMDV 01 VPl
141.160区域合成肽的KLH连接物,以小免疫剂量初次免疫豚鼠时,激发了豚鼠免疫系统对同一肽段再次小免疫剂量的特异性血清中和抗体反应,且再次反应不受载体限制。此外,当141.160肽与无免疫原性载体(例如small
unilamellar liDosomes)连接时也可诱发中和抗体反应,进而揭示FMDV
141.160肽段包含一个重要的中和抗体位点,可以激发自身T细胞辅助反应。随后,1987年,Francist3j等进一步报道了FMDV
VPl
141—160区域未连接肽激发豚鼠病毒中和性抗体产生需要初次接种时加入福氏不完全佐剂、肽c端存在未封闭巯基基团的半胱氨酸残基,而二次接种可以只接种肽不加佐剂。此外,146.156氨基酸序列对于诱导病毒中和抗体极为重要,拓展序列137—160区段可进一步促进该反应。

2.5SCFV全长感染性cDNA标记疫苗标记疫苗是在分子水平上,将具有选择性标记的基因克隆到致弱病毒全长cDNA中,经过检测,可以区分抗体来自于自然感染还是标记疫苗免疫,从而鉴别出感染猪群和免疫猪群。

FMDV的结构蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4组成,其中VP1是诱导机体产生免疫反应的主要结构蛋白。20世纪80年代以来,人们以FMDV的结构蛋白VP1,146
S和12
S蛋白亚单位等作为抗原免疫牛和豚鼠均可产生沉淀抗体、补体结合抗体及中和抗体。Vasantha等用脂质体包裹O型和Asia
1型FMDV的VP1制备亚单位疫苗,免疫豚鼠产生了高水平的中和抗体,小规模的田间试验也取得了比较好的效果。Kield等应用重组DNA技术首次在大肠埃希菌中表达了口蹄疫病毒主要保护性抗原VP1。以这种融合蛋白制备的实验疫苗,在牛和猪中均可诱导中和抗体产生。使用152
μg的融合蛋白重复接种,牛可抵抗A型口蹄疫病毒的攻击。Huang等则用含有半乳糖苷酶和一个完整的FMDV
VP1蛋白主要抗原决定簇的重组融合蛋白接种豚鼠和猪,可以产生特异性的中和抗体,起到有效的保护作用。Bitlle
根据口蹄疫病毒O1型VP1氨基酸序列分析资料,化学合成了140-160段氨基酸与载体蛋白偶联,能诱导保护豚鼠的中和抗体。Dimarch用合成的O1K病毒VP1的141段~158段和200段~213段氨基酸组成40个氨基酸短肽,在其中间加上两个脯氨酸和一个丝氨酸使多肽拆成立体构型,大大提高了单段肽在豚鼠的应答水平,并提出了VP1羧基端氨基酸在提高保护应答中的重要性。

由于人们认为B细胞表位可以被可诱发保护性病毒特异性免疫反应的线性短肽所模拟,如GH环和C末端区域,因而,Dimarch将FMDV
01K
VPl的141.158和200-213区域以线性结构连接,肽段间以Pro-Pro-Ser为间隔用于诱导一个折叠结构(即所谓的“DiMarchi”肽),可以激发豚鼠或者自然宿主具有显著抗FMDV中和性抗体和保护性,同时提出VPl碳端氨基酸对提高动物保护性的重要意义。

标记疫苗的开发有可能成为猪瘟疫苗发展的一个主要方向。1998年Moser等将编码细胞氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase,CAT)基因插入到Alfort/187株全长cDNA克隆pA187-1的Npro二者的酶活性。插入病毒的CAT基因在病毒传过10代后依然保持稳定。2000年deSmit等利用中国C-株的基因组DNA拷贝构建了2个重组CSFV。试验表明,重组病毒在兔和猪中保留了父代C-株的生物学特性和免疫原性。C-株全长cDNA可作为基质以开发活的重组CSFV标记疫苗。CSFV全长感染性cDNA标记疫苗,可有效地区别自然感染猪群与免疫猪群,是建立快速、准确的CSFV诊断试剂盒的基础;同时,CSFVC-株全长感染性cDNA标记疫苗的研制和开发,有望为我国C-株弱毒疫苗在西欧等国的推广铺平道路。随着研究的不断深入,不远的将来新型猪瘟疫苗将会陆续诞生,随之它对养猪业健康稳定的发展必将发挥重要保护作用.

这些亚单位疫苗与合成肽疫苗的免疫原性均基于它们能递呈VP1蛋白G-H环上的关键的抗原表位。然而,这些抗原位点不仅不是病毒粒子上惟一的中和性位点,也不一定能被所有的宿主动物识别,这导致这些疫苗在大规模使用时候,效果并不理想。如Taboga等应用138头牛进行4种合成肽疫苗的效果检测。结果表明各免疫组虽可产生相应的的免疫反应,甚至高水平的中和抗体,但它们对免疫动物的攻毒保护率没有一个在40%以上。此外,由于FMDV的高变异性和准种特性,使用有些的抗原表位,不仅不能有效地诱导保护性免疫,还会加速病毒的变异速度。如Taboga等就在未保护牛中分离到突变逃逸株。

1991年,FrancistT]报道以多抗原肽系统向免疫系统提呈FMDV VPl
140.160位点的二聚体、四聚体和八聚体结构比串联重复结构更能激发免疫反应。以赖氨酸连接的肽二聚体比单肽具有更好的免疫原性,四聚体比二聚体强5-10倍。在激发病毒中和抗体方面,四聚体多抗原肽体系与八聚体多抗原肽体系具有相当甚至更强的能力。另外,多抗原肽体系连接肽与氢氧化铝佐剂共同接种两次后可以显著激发中和抗体的特点,表现出与肽一载体连接物相似的特点。

2.4表位疫苗

1995年,Zamomno pt8]等用FMDV 01 Campos VPl
135.160位(p135—160)合成肽和覆盖该区域的重叠10mer合成肽研究对小鼠的免疫反应及保护性时发现,无论是否与载体蛋白BSA连接,p135.160均具有强免疫原性,可诱发小鼠长时间的中和抗体反应,并对病毒攻击提供坚强的保护,而10mer短肽只有与BSA连接后方可产生肽特异性抗体。值得注意的是135.144区域短肽以串联二聚体或三聚体形式存在是,不需与载体连接即可引起小鼠强烈的中和抗体反应及坚实的抗病毒攻击保护性。免疫亲和层析试验(immunoaffinity
chromatography)证明p135—160区域至少存在4个不连续的中和性位点,分别位于p135—144、p140—149、p145.154、p150.160。同时,抗原依赖性增殖试验(antigen-dependent
proliferation assays)和过继性细胞转移试验(adoptive cell transfer
assay)也证明了两个T细胞表位的存在,分别位于p135.144和p150—160区域。Zamorano的研究证明并发展了Francis在1987年的报道。1997年i
Zamorano等在先前研究基础上进一步探究了FMDV 01 Campos VPl
135—144位串联二聚体合成肽(p135.144×2)对牛体的免疫原性,在有效诱发牛强烈中和抗体反应同时,所产生的针对B和T细胞表位的反应既是VPl
135.144序列高度特异性的,又可在免疫牛体内长期持续存在。至此,Zamorano先后证明p135—144×2可被3种动物.小鼠、牛和豚鼠强烈识别,并产生T细胞特异性、保护性中和抗体反应。

研究表明,O型FMDV衣壳表面至少有5个抗原位点,其中位于VP1
140位~160位氨基酸处的A位点和位于VP1
C端200位~213位氨基酸C位点是两个B细胞表位能够诱导机体产生特异的FMDV中和抗体;AsiaI型FMDV抗原位点与O型FMDV相似;C型FMDV有4个抗原位点,A型FMDV抗原位点的命名和定位比较混乱,利用A10的单克隆抗体反应把A型FMDV的抗原位点分为4组。近年来为研制广谱的FMDV疫苗,FMDV非结构蛋白的抗原位点也引起了学者的关注,并且已经取得了较好的研究成果。
基于对FMDV抗原位点的研究,国内外学者相继进行了FMDV多表位疫苗的研究。Zhang
Hong-ying等[14]对FMDV
5个主要抗原表位和VP1上的T细胞表位,通过不同组合构建5种DNA疫苗,通过对免疫原性研究表明,含有T细胞表位和抗原位点1,5的DNA疫苗免疫效果好于其他组合的DNA疫苗。另外,为了增强FMDV
B细胞表位的免疫原性,Winther和Yahong
Huang等先后将B细胞表位与乙型肝炎病毒核蛋白融合表达,形成病毒样粒子,构建DNA疫苗或转染烟草构建了转基因植物多表位疫苗。Marchi等以钥孔虫戚血兰素作为骨架与B细胞表位融合表达,构建FMDV表位疫苗,通过对豚鼠、牛和猪的动物攻毒实验均表现出了良好的保护性。

由于有研究显示与FMDV免疫决定簇表位相对应的retro-inverso肽可以模拟天然形态L型.肽的结构和抗原活动。1996年,Benkiranev~~等针对FMDVVPl141.159环区域合成了一系列L.型和retro-inverso肽,并将其与含有单磷酰脂A(monophosphoryl
lipid A)的小单层脂质体(small unilamellar
liposomes)佐剂共价结合接种家兔制备抗体。在免疫接种早期retro-inverso肽比L一型肽诱导更高水平和更持久的血清抗体滴度,且与豚鼠抗VPl蛋白血清和病毒粒子的抗血清发生强烈交叉反应。该研究既证明retro-inverso
peptidomimetics比天然L一型肽更加稳定,也间接显示retro-inverso
peptidomimetics有望发展成合成肽疫苗的潜力。

李光金等[15]人工合成O 型FMDV 结构蛋白VP1
之上的141位~160位及21位~40位氨基酸残基2
个表位基因,并采用猪免疫球蛋白G
重链恒定区作为载体蛋白,将合成的抗原表位基因连接在载体蛋白基因的3′端,再克隆进真核表达载体pCDM8
中,构建成重组表达质粒pCDM8FZ3,检测了其诱发豚鼠产生免疫应答的情况。结果表明,构建的DNA
疫苗对豚鼠的保护率达66%,效果远远强于以整个IgG重链作为载体的DNA疫苗。马鸣潇等人利用计算机软件模拟分析,对O型、A型和Asia1型FMDV优势抗原表位进行了分子设计,先后构建了O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位DNA疫苗和鸡痘病毒重组活载体疫苗[16-17]。

合成肽作为免疫原存在的一个普遍问题是主要组织相容性复合体的限制性,FMDV是典型的细胞依赖性体液免疫为主,单纯B细胞位点肽诱导机体产生保护性有限,因而T细胞表位的引入对提高肽段的免疫性意义重大。但T细胞表位的识别受MHC限制,非选择性T11表位或病毒蛋白不同部分的特异性Tll表位的引入可极大解决这个问题。Brown等利用大肠杆菌表达的FMDV
VPl
140—160及200-213位肽段基因片段在免疫牛、猪等都获得了较好的免疫力。1988年BrownIll~研究发现FMDV
VPl上可以诱导豚鼠、牛和猪保护性中和抗体产生的免疫原性位点肽以二聚体或四聚体形式应用时可以诱导更强的中和抗体反应,当这些肽作为乙型肝炎病毒核心蛋白的一部分提供给动物时可以进一步提高保护性中和抗体产生能力。此外,接种适当连接到FMDV肽段上的T细胞位点可以激发小鼠体内的肽应答。

2.5可饲疫苗

1990年,Doeltl2~将分别用A、O、C血清型FMDV
VPl序列的141.158和200-213肽段组成的40个氨基酸合成肽,在牛和豚鼠进行试验,每个肽都产生高滴度的特异性抗病毒中和抗体,O、A型肽可完全保护豚鼠抵抗各同源病毒的攻击,C型较差。

可饲
疫苗即利用农杆菌或基因枪等技术,将免疫原性基因导入植株中,获得能表达免疫原基因的植株。FMD
转基因植物可饲疫苗是研究较早,并且效果较好的例子之一。早在1998
年,Carrillo 等用FMDV 的主要保护性抗原基因VP1
获得了转基因拟南芥,用叶浸提物免疫小鼠,可诱导产生特异性抗体,所有免疫的小鼠都能抵抗FMDV
强毒半数致死量的攻击,这是有关转基因植物表达的病毒抗原使免疫动物全部获得保护的首篇报道,而且一个免疫剂量仅为25
mg~50 mg 叶片 。2001年Carrillo
等以马铃薯作为受体材料,成功获得了表达FMDV VP1
的转基因马铃薯,动物试验证实免疫鼠也能抵抗强毒的攻击[18]。

2002年,Wang[13]以VPl
G-H环及大量侧翼序列为框架,将共有残基整合进入VPl高变区位点,并引入外源Th位点设计的合成肽疫苗,以12.5¨g剂量免疫猪,以01Taiwan株FMDV攻击时获得20/21保护率。该设计拓宽了肽疫苗在多个物种的免疫原性,通过引入循环约束和毗邻序列(cyclic
constraint and adjoining sequences)肽优化了对不同毒株的交叉反应性。

最近Santos M D等[19]又利用苜蓿作为受体材料,成功获得了共表达FMDV
P1基因和3C基因的转基因苜蓿, 进行鼠免疫能100
%抵抗致死剂量强毒的攻击。FMDV
转基因植物可饲疫苗的研究成功,将为牛、羊等草食动物FMD
的防治带来光明的前景。

2007年,Wang等研究发现Asia 1型FMDV YNBS/58分离株VPl 133—163和VP2
1—33上存在抗原表位,二者均可诱导豚鼠淋巴细胞增殖,但仅有VPl上片段可诱导中和抗体产生,但VP2肽段可显著提高VPl肽诱导中和抗体产生能力。

2003年Wu Ligang等[20]用烟草作为受体,分别表达FMDV
VP1蛋白上的11个氨基酸和14个氨基酸短肽的转基因植物疫苗TMVF11和TMVF14。小鼠、豚鼠和猪的免疫试验研究结果表明,两种TMVF11和TMVF14的混合物免疫小鼠可以保护乳鼠抵抗10个乳鼠的半数致死量的攻击,免疫豚鼠,可抵抗150个豚鼠半数感染量的攻击,而猪可抵抗20个最小感染量FMDV
的攻击。

2005年,BeignontlSj以霍乱毒素为佐剂,将FMDV VPl
G-H环141.159区域合成肽.BSA连接物皮下接种小鼠,激发产生具有强烈病毒中和活性的抗肽抗体反应。联合应用霍乱毒素与免疫刺激性CoG基序,可诱导具有显著增强病毒中和活性的IgGl和IgG2a型抗肽抗体的产生。

2008年Pan L等[21]在西红柿中实现了FMDV
P1-2A基因和3C基因,其提取物可对豚鼠的攻毒产生完全保护,表明该转基因的西红柿有望成为预防FMDV的新型疫苗。

2007年,SuV61等以结核分支杆菌热休克蛋白70为佐剂和载体融合表达了来自O型FMDV
Tibet/CH A99株的五个B细胞位点(VPl 141.160和200-213,VPl 41—60,VPl
135—167,VP2 70-77,131.134,VP3 55-59)和两个T细胞位点(vPl
21.40和141.160)的多表位合成基因,在小鼠诱导了比VPl融合表达物更为显著的体液和细胞免疫反应,并促进了IL-4和IFN-r的分泌。

倪志华等[22]在粳稻品种日本晴中成功表达了口蹄疫O 型抗原决定簇和A
型抗原决定簇构成的融合基因O21-O14-A 21。

2007年,Zhang报道,与GST融合表达相比,以缺失c/el区域75.82aa的乙肝病毒核心为载体表达的口蹄疫VPl(141—160)一VP4(21—40)一VPl(141—160)]具有更高的肽特异性和病毒特异性抗体滴度。从而也间接印证了1988年,Brown的报道。

李文建等[23]在胡萝卜中也成功地表达该融合基因。这些研究成果为我国FMDV转基因疫苗的研究奠定了基础。

2007年,Gemert’81利用来自实验感染FMDV牛的淋巴细胞增殖实验筛查了覆盖FMDV结构蛋白的442个重叠15肽,结果发现结构蛋白VPl
66-80位氨基酸残基区域为一免疫优势表位,MHC血清型为A31。2008年DH091等以腺病毒为载体将FMDV
VPl
21.60、141—160、200-213三段氨基酸残基序列与猪IFN-a融合表达,该表达物诱发的小鼠FMDV特异性的体液和细胞免疫反应显著高于三段残基序列与干扰素混合物组,所有接种豚鼠和猪均可完全抵抗病毒攻击,获得保护性。

总之,尽管新型基因工程疫苗的快速发展给FMDV疫苗研究带来了新的变革,然而,新型基因工程疫苗也普遍存在着明显的不足,即新型基因工程疫苗刺激机体产生免疫应答的能力往往比常规疫苗接种引起的免疫反应弱,这就给新型基因工程疫苗的研究提出了新的挑战。因此,新型疫苗佐剂已成为当今倍受关注的研究热点。目前,作为新型基因工程疫苗的佐剂主要有细胞因子、CpG岛、超抗原SEA(staphylococcus
enterotoxin A,
SEA)、脂质体、中药佐剂及某些化学合成试剂等,这些新型基因工程疫苗的佐剂在FMDV新型疫苗研究中已被广泛应用。

2008年,Cubillost2~~合成了含有1个FMDVT细胞抗原决定簇和具有4个分支的B细胞抗原决定簇的树形肽,把这种树形肽注射到猪的肌肉后,四头免疫猪未出现病毒攻击后的显著临床症状,系统和粘膜无FMDV复制。成功使猪获得对FMDV攻击的保护。肠胃外给肽时,局部和全身均观察到有效的抗FMDV
IgA型反应。

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2008年,Greenwoodt2’~以惰性纳米磁珠为载体与不同T、B细胞位点序列肽FMDV
01K上VPl126—150、141—165、189-213单独或混合物连接时发现,虽然单序列肽纳米磁珠可以诱导多数实验羊产生抗FMDV特异性合成肽反应,但多个肽序列不管是单独或混合物的纳米磁珠连接物均可诱导显著的细胞和体液免疫反应。

3、展望

合成肽疫苗的研究最早始于FMDV合成肽疫苗,随着肽合成技术的日益成熟和普及,加之口蹄疫病毒抗原表位的明朗,使得口蹄疫多肽疫苗越来越受到人们的重视,并呈现迅猛的发展态势。许多研究者在FMDV合成肽疫苗领域进行了有益探索,但这些研究大多局限于结构蛋白尤其是VPl上抗原位点,特别是140—160和200-213残基附近。不同研究中所选抗原区域不同,鲜有共识性和可激发中和性抗体产生且能抵抗FMDV攻击的核心位点和肽段的报道。与经典程序疫苗相比,肽基础的合成疫苗在稳定性、易获取性、安全、纯化及成本方面具有明显优势,但也存在着免疫原性弱、半衰期短等缺点。这与构成抗原位点的氨基酸序列有关,导致合成肽疫苗中所选用肽段多为小肽,且现有合成技术只能合成直链肽段,其三维空间结构与完整分子不尽相同密切相。为了提高FMDV小肽免疫原性,研究者采用了以下方法:①设计线性肽的串联重复结构;②与载体蛋白连接;③将小肽插入诸如多抗原肽系统支架结构;④插入病毒载体(如乙肝病毒核心蛋白HBc)、热休克蛋白、细胞因子、佐剂、免疫增强序列,构建重组蛋白。

合成肽疫苗在口蹄疫的防治中具有巨大的优势和潜力,尽管目前仍存在诸多不足,但随着肽合成技术的发展,核心抗原肽的进一步鉴定,MHC限制作用的消除以及增强肽免疫性技术的革新,口蹄疫合成肽疫苗必将在未来口蹄疫的防治乃至根除中展现出广阔的应用前景。

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